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      酵母提取物酵母甘露寡糖對圍產期奶牛瘤胃微生物區系的影響

      2022-01-26 16:38:51

              今日拓普小編為您分享酵母提取物酵母甘露寡糖對圍產期奶牛瘤胃微生物區系的影響

       奶牛圍產期是奶牛生理上的劇變時期,能量需要量急劇增加。但是,由于產犢應激和妊娠期瘤胃體積的壓縮,采食量遲遲不能恢復,無法滿足能量需要而出現能量負平衡現象(NEB)。在NEB狀態下,奶牛的機體代謝發生變化,影響奶牛對于營養物質的吸收與利用,終導致奶牛生產性能下降。NEB還會增加體脂動員,導致肝臟中非酯化脂肪酸(NEFA)蓄積,引起脂肪肝和酮病等營養代謝病。近年來,研究人員不斷尋求緩解圍產期奶牛NEB的策略。


        甘露寡糖(MOS)是一種功能性寡糖,能夠提高畜禽的生產性能,有改善反芻動物免疫性能、緩解能量負平衡的潛力,但其作用機理尚不明確。在高產奶牛的研究中發現,MOS能夠通過提高泌乳期奶牛瘤胃中纖維降解菌的相對豐度、促進纖維降解、提高瘤胃乙酸產量;還能通過降低乳酸產生菌豐度、提高乳酸利用菌豐度減少瘤胃的乳酸蓄積,穩定瘤胃pH值。由于圍產期日糧與高產奶牛的不同以及機體代謝活動的巨大差異,其瘤胃微生物區系與發酵模式與高產奶牛均有較大差異。生產上也缺乏圍產期奶牛MOS適宜添加劑量的研究。因此,試驗研究在圍產期奶牛飼糧中添加不同劑量MOS對圍產期奶牛瘤胃發酵及瘤胃微生物菌群的影響。探索通過調控瘤胃代謝以緩解圍產期奶牛NEB的途徑,并嘗試尋找圍產期奶牛飼糧中添加的適宜濃度。


      1、材料與方法


      1.1 試驗設計與試驗動物


        取胎次(1.9±0.7)胎、體況評分3.43±0.24、上一泌乳周期產奶量及預產日期相近的干奶前期荷斯坦奶牛60頭,按照隨機區組試驗設計方法,分為4組(C、L、M和H組),每組15頭。C組奶牛飼喂基礎飼糧,L、M和H組分別在基礎飼糧基礎上添加5、10和15 g/(頭d)MOS(奧特奇公司生產)。每天早上投料后,立刻將相應劑量的MOS撒在對應的奶牛飼料表面,確保添加的MOS被全部攝入。試驗期為預產期前21d至產后21d停止飼喂。試驗奶牛在產前飼喂圍產前期飼糧,圍產前期基礎飼糧組成及營養水平見表1。每天分別于7:00和18:00飼喂2次。產后飼喂圍產后期基礎飼糧,圍產后期基礎飼糧組成及營養水平見表2。每天分別于6:30、14:30和19:30飼喂3次。試驗期間自由飲水。產后1~7 d之內,每天分別于6:00和14:00擠奶2次;產后7~21d之內,每天分別于6:00、14:00和19:00擠奶3次。


      表 1 圍產前期基礎飼糧組成及營養水平


      (干物質基礎)


      表2 圍產后期基礎飼糧組成及營養水平


      (干物質基礎)


      圖片蛋白(MCP);第二份低溫離心機中10000×g離心10min,取3.0 mL上清液,加入0.3mL偏磷酸,搖勻,靜置30min,10000×g低溫離心15 min,取上清,用以測定VFA;第三份置于紗布袋中,投入液氮罐內運回實驗室,-80℃保存,以待用16S rDNA高通量測序分析技術檢測瘤胃液微生物菌群。


      1.3 測定指標及方法


      1.3.1 瘤胃發酵指標的測定


        采用差速離心法和凱氏定氮法測定瘤胃液的MCP。計算公式如下:X=[(V1-V2)×N×0.014/(V×10/100)]×6.25×100%  (1)式中:X為樣品中蛋白質的百分含量;V1為樣品消耗硫酸標準液的體積(mL);V2 為空白對照消耗硫酸標準液的體積(mL);N為硫酸標準液的當量濃度;V為樣品的體積(mL)。利用Agilent 7890A氣相色譜檢測儀采用外標分析法測定瘤胃液VFA。


      1.3.2 瘤胃微生物菌群的測定


        采用SDS方法提取樣本的基因組DNA,將稀釋過的基因組DNA作為模板,選擇16S V4區作為擴增區域,使用New England Biolabs公司的Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer以及保真酶,選擇帶Barcode的515F-806R作為特異性引物,用Qiagen公司提供的膠回收試劑盒回收目的條帶。


        使用 TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit試劑盒進行構建基因組文庫。之后用 Qubit 和 Q-PCR 定量檢測構建好的基因組文庫,文庫合格后,使用HiSeq2500 PE250進行上機測序。測序服務由北京諾禾致源生物信息科技有限公司提供。


      1.4 數據統計與分析


        數據采用SAS 9.4的MIXED模型進行分析,用PDIFF校正的Tukey模型進行多重比較。用 Contrast 語句對NCG劑量的線性、二次和三次效應進行評估。結果以平均值和標準誤差表示,采用Pearson方法對試驗數據進行相關性分析。P<0.05為組間差異顯著,0.05<P<0.10為組間差異有趨勢。


      2、結果與分析


      2.1 MOS對產后21d奶牛瘤胃發酵指標的影響(見表3)


      表3 MOS對產后21 d奶牛瘤胃發酵指標的影響


        由表3可知,隨著MOS添加量的增加,奶牛產后21d瘤胃液中微生物蛋白含量、總揮發性脂肪酸濃度、乙酸、丙酸、丁酸和異丁酸的濃度和乙丙比均線性上升(P<0.05)。


      2.2 MOS對產后21d奶牛瘤胃微生物OTUs數量的影響(見圖 1)



        用Uparse軟件對所有樣本Tags進行聚類,以97%一致性聚類為OTUs。


        由圖1可知,C、L、M和H組OTUs數分別為2196、2156、2204和2063,4組樣本OTUs相似度較高,有1741個OTUs為4組共有。


      2.3 MOS對產后21d奶牛瘤胃微生物Alpha多樣性的影響(見表4)


      表4 MOS對產后21d奶牛瘤胃微生物Alpha多樣性的影響


        由表4可知,各組樣本間Alpha多樣性指標均差異不顯著(P>0.05)。


      2.4 MOS對產后21d奶牛瘤胃菌群結構的影響(見表5、表6)


      表5 MOS對產后21d奶牛瘤胃微生物門水平菌群結構的影響


      表6 MOS對產后21d奶牛瘤胃微生物屬水平菌群結構的影響


        由表5可知,4組樣品共涉及11個門,各組相對豐度高的菌群均為擬桿菌門 (Bacteroidetes),此后依次是厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)。這3類菌占各組菌群相對豐度的90%以上。雖然MOS處理對大部分菌門均無顯著影響,但是隨著 MOS添加量的增加,厚壁菌門和藍藻菌門相對豐度呈線性下降(P<0.01),纖維桿菌門具有二次上升趨勢(P<0.10),淋溶菌門 (Elusimicrobia) 相對豐度線性上升 (P<0.05)。


        由表6可知,在豐度前10的屬中,隨著MOS添加量的提高,除毛螺菌屬呈現線性下降的趨勢(P<0.10),纖維桿菌屬呈現二次變化的趨勢(P<0.10)外,其余各屬均無顯著變化(P>0.05)。


      2.5 部分瘤胃液菌群與MOS及瘤胃發酵指標的相關性(見表7)


      表7 部分瘤胃液菌群與MOS及瘤胃發酵指標的相關性

      酵母甘露寡糖

        由表7可知,20個樣品中檢測到147個屬,11個屬與MOS添加量顯著相關,8個屬顯著負相關,3個屬顯著正相關。11個屬主要來自厚壁菌門(Firmicutes)(9/11),其余來自放線菌門(Actinobacteria)和淋溶菌門(Elusimicrobia)。瘤胃梭菌屬1豐度的變化與瘤胃乙酸、異丁酸、總揮發性脂肪酸、微生物蛋白以及丁酸含量呈顯著正相關。隨著MOS添加量的升高,高夫羅瘤胃球菌屬(Ruminococcus gauvreauii)、蒜頭藻屬(Allisonella)、溶纖維真桿菌屬(Eubacterium cellulosolvens)、Shuttleworthia以及梭狀芽孢桿菌屬1(Lachnoclostridium 1)等菌屬豐度下降。其中,Allisonella、Lachnoclostridium 1 與乙酸、丁酸以及TVFA含量顯著負相關;Ruminococcus gauvreauii與乙酸、TVFA含量顯著負相關,與丙酸含量極顯著負相關;Shuttleworthia與乙酸、丁酸含量顯著負相關,與TVFA含量極顯著負相關。


      3、討論


        本試驗中,隨著MOS添加量的增加,瘤胃液中微生物蛋白與乙酸的含量均顯著升高。研究表明,飼糧中添加外源性MOS能夠改善瘤胃發酵,提高瘤胃液微生物蛋白與乙酸的含量。也有研究發現,MOS對于綿羊體外瘤胃發酵指標均未產生顯著影響。結果不同可能與所用飼糧結構不同有關。陳志龍等研究發現,在綿羊體外瘤胃發酵中,MOS添加量與飼糧精粗比之間存在交互作用。本試驗前期采用低能量水平飼糧,后期換用高能量水平飼糧,飼糧結構的變化會導致瘤胃微生物區系發生變化。而MOS對于瘤胃發酵指標的影響則主要是通過調節瘤胃微生物區系而實現。本試驗中,盡管微生物蛋白和瘤胃發酵指標出現顯著變化,但瘤胃液菌群Alpha多樣性無顯著差異,與郭婷婷等的研究結果一致,可能是因為MOS調控發酵主要是通過調節瘤胃液微生物的菌群結構而非多樣性來實現的。


        在不同能量水平下,MOS對于瘤胃微生物菌群相對豐度的影響不盡相同。MOS能夠極顯著降低高產奶牛瘤胃液中藍藻門(Cyanobacteria)細菌的相對豐度,對厚壁菌門及纖維桿菌門豐度無顯著影響,但對于高精料誘導下的低乳脂奶牛而言,MOS對瘤胃液中藍藻門細菌的相對豐度無顯著影響,卻顯著提高厚壁菌門、纖維桿菌門細菌的豐度。厚壁菌門與纖維桿菌門細菌是牛瘤胃中較為主要的菌群,可以產生大量纖維素酶。研究表明,外源添加MOS能夠提高奶牛瘤胃中纖維素降解菌的活性和數量,有可能是通過提高厚壁菌門、纖維桿菌門細菌的相對豐度而實現的。本試驗中,纖維降解菌的相對豐度隨著外源性MOS添加量的提高而升高,從而提高對日糧的纖維降解率,與瘤胃中乙酸濃度的提高相一致。


        根據瘤胃液中出現顯著變化的菌屬與瘤胃發酵指標的相關性分析,MOS添加量與Ruminococcus gauvreauii、Allisonella、Eubacterium cellulosolvens、Shuttleworthia以及Lachnoclostridium 1等厚壁菌門菌屬有較強的負相關性。Eubacterium cellulosolvens可以產生纖維素酶分解纖維素,然而其纖維素分解活性受到碳水化合物的抑制,這種效應被稱為碳分解代謝抑制。Eubacterium cellulosolvens的許多菌種僅能利用纖維素或纖維二糖作為分解底物。當淀粉等可溶性碳水化合物含量較高時,其對于纖維素的分解能力會受到碳分解代謝抑制的影響。本試驗中,由于添加MOS,能夠促進纖維素的分解,提高瘤胃液中碳水化合物的水平,因此,Eubacterium cellulosolvens與MOS添加量呈現顯著負相關。動物消化道中的Ruminococcus gauvreauii、Shuttleworthia與Lachnoclostridium 1或許與疾病的發生有關。Ruminococcus gauvreauii是一種嚴格厭氧的革蘭氏陽性球菌,在患糖尿病大鼠腸道中相對豐度顯著提高;在限制飲水的條件下,Shuttleworthia在紹興鴨后腸道中的相對豐度顯著上升;而Lachnoclostridium 1則可作為標記物,用以診斷內源性大腸腺瘤和癌癥的發生。添加MOS降低了瘤胃液中Shuttleworthia與Lachnoclostridium 1的豐度,可能是因為MOS能夠提高動物免疫性能。瘤胃液中組胺含量過高會導致mTOR自噬通路受到抑制,清除有害物質的功能減弱,引起細胞損傷。組胺往往 通過組氨酸脫羧形成,然而,Allisonella在不分解組氨酸的情況下也能夠產生組胺。MOS降低Allisonella豐度,有利于減少組胺的產生,促進有害物質的清除。此外,MOS還可能通過增加Ruminiclostridium 1的相對豐度提高VFA的含量,因為該菌屬與乙酸、異丁酸以及TVFA 含量均有顯著正相關性。纖維素在瘤胃內往往先被纖維分解菌分解為纖維二糖和纖維糊精,Ruminiclostridium 1是一種,其可以產生纖維二糖磷酸化酶以及纖維糊精磷酸化酶,進一步分解纖維二糖和纖維糊精。


      4、結論


      圍產期飼糧中添加MOS雖然對瘤胃微生物的Alpha多樣性影響不顯著,但是顯著提高瘤胃揮發性脂肪酸濃度、乙丙比和微生物蛋白水平,促進瘤胃發酵。相關性分析表明,MOS添加對瘤胃發酵的促進作用可能主要是通過調節菌群結構、促進纖維分解、降低疾病相關細菌豐度、改善瘤胃健康實現的。圍產期奶牛日糧中MOS的添加量為15 g/(頭·d)

                                                                                                                                                                                                ——摘自《反芻動物營養》No.04 2021

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